PCR技术检测致病真菌感染研究 本文关键词：真菌，致病，感染，检测，研究
PCR技术检测致病真菌感染研究 本文简介：［摘要］目的建立适合临床实践的常见致病真菌的PCＲ检测方法。方法根据真菌的保守基因设计不同的特异性引物，对152例临床标本进行PCＲ检测，与传统检验方法的结果进行比较。结果真菌培养阳性46例;真菌PCＲ检测阳性57例，分别为白色念珠菌感染30份、烟曲霉感染9份、黄曲菌感染8份，其他真菌感染10份。两
PCR技术检测致病真菌感染研究 本文内容：
［摘要］目的建立适合临床实践的常见致病真菌的PCＲ检测方法。方法根据真菌的保守基因设计不同的特异性引物，对152例临床标本进行PCＲ检测，与传统检验方法的结果进行比较。结果真菌培养阳性46例;真菌PCＲ检测阳性57例，分别为白色念珠菌感染30份、烟曲霉感染9份、黄曲菌感染8份，其他真菌感染10份。两种方法比较，检出率差异无统计学意义。结论PCＲ法可快速、特异、灵敏地检测致病真菌，适合临床实验室的快速诊断。
［关键词］真菌;聚合酶链反应;白色念珠菌
近年来，由于广谱抗生素、免疫抑制剂和抗肿瘤药物的大量使用，临床真菌感染日益增加，特别是免疫力低下及长期接受侵袭性治疗的患者逐渐增加，侵袭性真菌感染的形势非常严重［1］。目前，真菌感染的检测主要依据常规镜检或传统培养法，但由于操作烦琐、周期长等原因，延误了对真菌感染患者的诊断，为此迫切需要发展快速准确的检测方法。本研究分别选择了真菌通用引物和白念珠菌、烟曲霉和黄曲霉的特异性引物，通过PCＲ对152份可疑深部真菌感染临床标本进行快速检测，并与传统培养方法进行比较，为致病真菌感染快速检测奠定基础。
1材料与方法
1.1材料1.1.1临床标本收集痰液15份、血液32份、支气管肺泡灌洗液6份、尿液10份、脑脊液12份、胸水11份、角膜分泌物50份及各种创面分泌物16份，共计152份，均来自本院检验科微生物检验室。1.1.2主要试剂与仪器PCＲ仪和凝胶成像系统购于美国伯乐公司、电泳仪购于北京六一仪器厂;核酸提取试剂盒购于泰普生物科学有限公司;PCＲ反应试剂和PCＲ纯化试剂盒购于天根生化科技有限公司;PCＲ引物由苏州金唯智公司合成。1.2方法1.2.1PCＲ引物设计通用引物的设计参考文献［2－3］，选用真菌通用型引物ITS1和ITS4，ITS1和ITS4扩增的片段由于菌种不同变化范围在500bp－600bp。根据白色念珠菌、烟曲霉和黄曲霉靶基因设计的特异性引物，然后进行BLAST比对，筛选出理论上最好的引物进行合成。白色念珠菌特异性引物:5’－AAGCGTTCATTGATGTTGTCAGA－3’，5’－AGAAATTATATAAAGGGTCTTAA－3’，可扩增出380bp的DNA片段;烟曲霉特异性引物:5’－GT-CAGTCCCCGCCCTCAGACTAC－3’，5’－AGAT-AGAAAAGCCCAAACCAGAG－3’，可扩增出508bp的DNA片段;黄曲霉特异性引物:5’－CACCCGT-GTTTACTGTACCTTAG－3’，5’－GGACGACGAC-CCAACACACAAGC－3’，可扩增出345bp的DNA片段。1.2.2真菌DNA的提取实验所取的标本中加入1.0mL清洗液，充分振荡摇匀，使之成为均一的液体;吸取液体转移至1.5mL离心管中，13000rpm离心5min，弃上清;再加入1.0mL清洗液震荡重悬，13000rpm离心5min弃上清;加入100uL核酸提取液将沉淀重悬，加入1管提取固形物，用强力震荡器高速涡旋震荡5min，瞬时离心;95℃干浴2min，即刻冰浴5min，13000rpm离心5min，取上清液作为PCＲ反应的模板(－20℃保存)。1.2.3PCＲ反应以真菌DNA为模板，用引物扩增相应的片段，反应体系如下:Mix溶液25μL、上下游引物各1.5μL、模板DNA1μL，加双蒸馏水至50μL。PCＲ反应条件:94℃5min;94℃1min，55℃1min，72℃1min，30个循环;72℃10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察特异性扩增条带。1.2.4PCＲ产物测序及序列分析PCＲ产物经电泳鉴定，如果出现目标带，则将PCＲ产物纯化后送苏州金唯智公司测序，测序结果在Gen－Bank中应用Blast进行同源性比对，参照文献［4］如果序列同源性≥97%为同一属，同源性≥99%为同一种;如果未出现目标带，则为阴性。1.2.5常规真菌培养将152份标本接种在沙堡平板中，分别在28℃和35℃恒温培养箱内培养1～7天，每天观察，是否有真菌或可疑菌落生长。1.2.6统计学处理统计方法为卡方检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1PCＲ检测结果用真菌通用型引物ITS1和ITS4对152份标本进行PCＲ法检测，扩增结果见图1。在8种不同类型的标本中扩增出约500bp左右的目的片段，而阴性对照(人全血细胞)未扩增出目的片段。在152份标本中，真菌通用引物检测阳性57例，检出率为37.5%。然后用特异性引物进行扩增(见图2)，将特异性PCＲ扩增产物纯化后送苏州金唯智公司测序，经序列比对发现白色念珠菌感染30份，烟曲霉感染9份，黄曲菌感染8份，其他真菌感染10份。2.2常规真菌培养法和PCＲ法的比较在152份标本中，常规真菌培养法检测阳性46例，检出率为30.2%，低于PCＲ法的检出率(37.5%)，经卡方检验分析，X2为1.78(P＞0.05)，表明两种方法检出率差异无统计学意义。
3讨论
一般情况下，条件致病真菌会在适当的部位定植，但不会引起机体的感染，如果机体的抵抗力下降或者菌群失调，从而造成天然屏障的结构破坏，定植真菌就会引发侵袭性的感染，并导致严重的临床后果。由此可以看出，对侵袭性真菌的检测对患者的治疗具有重要意义。常规的真菌培养检测耗时较长，多数需要7～14天左右，而且大部分真菌侵袭患者多为免疫力低下的病人，如果错过最佳的治疗时机，可能会影响患者的救治。随着真菌感染患者的日益增多，临床医生已很重视对病人进行真菌检测。1990年，一些学者提出将核糖体基因转录间隔区ITS发展成为一种新的分子标记，其优点在于具有高拷贝数，包含了保守和变异序列。由于真菌ITS区段具有保守性，又在属间及同属不同种间存在着广泛的多态性，因此可以用PCＲ扩增ITS区，然后进行测序，这样就能诊断和检测真菌，这为真菌的鉴定提供了一个强有力的工具。PCＲ法能够克服传统培养法的诸多缺陷，只需要1天就能对常规真菌感染进行鉴定，大大缩短了检测时间，提高检测效率。由于不依赖菌体的生长状态和形态学表型，与传统的真菌培养比较，操作简单，敏感性更高，即可用少量的DNA就能进行鉴定，并且准确鉴定到种，对临床诊断很有意义，同时有利于抗真菌治疗药物的选择，为临床医生的精准用药奠定基础［5］。本研究首先用真菌通用型引物对152例临床标本进行PCＲ检测，阳性57例，与传统真菌培养结果差异无统计学意义。目前，侵袭性真菌感染多以白色念珠菌和曲霉菌感染最为常见，约占真菌感染的70%～80%［6］，为此根据白色念珠菌、烟曲霉和黄曲霉靶基因设计特异性引物，对57例阳性样本鉴定到种，结果为白色念珠菌30例、烟曲霉9例、黄曲菌8例，其他真菌感染10例。此外，本研究多用无菌体液为主，这样可以克服由于污染而造成的假阳性。PCＲ法能快速、灵敏地对真菌感染进行鉴定，为临床使用抗真菌药物提供重要参考依据，可以开发为一种快速诊断真菌的检测方法。PCＲ技术检测病原真菌也有自身的一些缺点，例如:PCＲ技术检测病原真菌只能判断标本中是否有真菌存在，但不能确定是否是致病真菌，也不能确定是活菌还是死菌，同时也不能对抗真菌药物的敏感性和耐药性进行检测。因此，PCＲ技术检测应该和其他方法联合应用，同时结合患者的临床症状及影像学特征，有利于对真菌感染患者的准确医治。
作者：王宇 郑秋冬 邓琴 刘宁远 潘婷 单位：攀枝花学院医学院 攀枝花学院附属医院
PCR技术检测致病真菌感染研究 来源：网络整理
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