非洲猪瘟检疫技术规范 本文简介：
非洲猪瘟(Africanswinefever，简称ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病其特征为病程短，病死率高，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。为世界动物卫生组织[WorldOrganizationforAni
非洲猪瘟检疫技术规范 本文内容：
非洲
猪
瘟
(Africans
winef
ever，简称ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、
高度接触传染性疾病其特征为病程短，病死率高，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、
皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。为世界动物卫生组织[World
Organization
for
Animal
Health(英)，
Office
Intentional
des
Epizootic(法),OIE]和我国规定的动物一类疾病。病毒在鲜肉和腌肉中能存活数
月。
AS
F
的
实验室诊断分为两类:第一类包括病毒分离、病毒抗原和基因组
DNA的检测;第二类包括
抗体的检测。试验方法的选择主要依据本国或本地区的疾病情况而定。在没有ASF但又怀疑该病存在
的国家，实验室诊断必须应用无感染性的诊断方法，即应用聚合酶链反应(PCR)检测病毒基因组DNA
和应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体
我
国是
无
ASF国家，目前尚无ASF的检疫方法。农业部动物检疫所于199?年与美国梅岛动物病
研究中心进行了ASF的无感染性快速检测方法的合作研究，建立了适合于我国使用的由可疑感染动物
血液和内脏器官中直接检测ASFV
DNA的PCR技术，以及检测血清中ASFV抗体的ELISA方法。本
标准对这两种方法技术要求作了规定
本标
准
的
附录A、附录B和附录C都是标准的附录。
本标
准
由
中华人民共和国农业部提出。
本标
准
由
全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本
标
准起
草单位:农业部动物检疫所。
本
标
准
主要起草人:蒋正军、王树双、尹燕博、蔡丽娟、郭福生、陆明哲、孙淑芳、龚振华。
中
华
人
民
共
和
国
国
家
标
准
非洲猪瘟诊断技术
GB/"r
18648-2002
Diagnostic
techniques
for
African
swine
fever
范围
本标准规定了非洲猪瘟(ASF)聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)的技术要求。
本标准适用于生猪和野猪等易感动物及其产品ASF的诊断和检疫。
2
PCR试验
2.1
材料准备
2.1.1
样品DNA制备方法见附录A(标准的附录)。
2.1.2
电泳液缓冲液的配制方法见附录B(标准的附录)。
2.1.3
标准ASFV-BA_株DNA、引物1、引物2,1.25
m
mol/Ld
N丁P和载样缓冲液。
2.1.4
台克(Taq)D
NA聚合酶、分子量为100碱基对(bp)Ladder(标准DNA
Marker)0和10倍浓度
的聚合酶链反应(PCR)扩增缓冲液。
2.1
.5
自动DNA热循环仪。
2.2
操作方法
2.2.1
将下列试剂按要求量加人到0.75
m
L的离心管中:灭菌蒸馏水(24.5
风);10倍浓度的PCR扩
增缓冲液(5
VL);1.
25
mmol/L
dNTP贮存液(8
pL);引物1(1
pL);引物2(1
pL);样品DNA溶液
(10
JAI)(见附录A);Taq
DNA聚合酶(。.5
PI)。
2.2.2
设定两个对照，阳性对照为标准的ASFV-BA，株的10
pL
DNA含量为10
fg;阴性对照为不含
DNA的灭菌蒸馏水10讨。
2.2.3
取50
pl矿物油覆盖在混合液上。
2.2.4
将加有样品或对照混合物的Eppendorf管放人自动DNA热环仪中，按下述程序和条件进行
DNA扩增
94C
5m
in,50
一
C2m
in,72
C3
m
in循环一次;94C1m
in,50
"C"2m
in,72
C3
m
in循环30次;
94
C1
min,50"C2
min,72"C10
min循环一次，最后置于4"C保存。
2.2.5
上述步骤完成后，从矿物油下小心取出每种反应混合物20
pL，放人另一支干净的Eppendorf
管中并加2
pL载样缓冲液。
2.2.6
将所有样品按编号加人到对应2%琼脂凝胶(见附录B1)板的各孔中，其中一孔加标准阳性
DNA样品。在凝胶的边孔中加人标准分子量DNA
Marker,
2.2.
7
将凝胶在150
v恒定电压下电泳2
ha
2.2.8
结果判定:用紫外光源检查凝胶。如为阳性样品，则出现一条孤立的、与阳性对照PCR产物的同
步迁移的带，分子量为265
bp,阴性对照和非ASF感染猪无265
by带。
3
酶联免疫吸附试验(ELISA
)
3门试剂:标准抗原
中华人民共和国国家质t监督检验检疫总局2002-02-19批准20D2一05一01实施
Gs/"r
18648-2002
;.;0.
1
mol/L磷酸盐缓冲液(制备方法见附录Cl)，底物溶液(见附录C2),
操作方法
3.3.1
取EIASA微量滴定板，每孔加人用。I
mol/L
pH7.
2磷酸盐缓冲液稀释至工作滴度的抗原溶
液50
pL，封板后于4C作用16
h(过夜)
3.3.2
用pH7.2
的0.1
m
ol/L磷酸盐缓冲液洗板3次，每次2m
in,
3.3.3
用含。.05Y,吐温一20的。.
1
mol/I磷酸盐缓冲液溶液，将待检血清以及阳性和阴性对照血清作
30倍稀释，将稀释的血清加人用抗原包被的孔中，每孔中加50川J。
13.4
将滴定板放在微量振荡器上，37
C作用30
min,然后用。.1
mol/L磷酸盐缓冲液洗3次
3.3.5
每孔加人50
pL用含0.05%吐温一20的。.
1
moll,磷酸盐缓冲液配制的免疫球蛋白G(IgG)
抗猪过氧化物酶结合物溶液
3.3.6
将滴定板放人振荡器，37℃作用于1h，然后用。.1
mol/I磷酸盐缓冲液洗3次
3.3.7
每孔加50
p1一底物溶液。
3.3.8
室温下显色15
min,
I19
每孔加50
pL,l
mol/I的硫酸终止反应
3.3.10
判定结果:阳性血清可以用肉眼辩认，为清亮的黄色，用ELISA检测仪检测每一孔的光吸收
值，检测波长为492
nm。任何一种血清，只要它的吸收值超过同一块板中阴性对照血清平均吸收值的两
倍，就可判为是阳性。
GB/T
18648-2002
附
录
A
(标
准的附录)
样品DNA的制备
Al
将组织放人有灭菌沙子的研钵中研磨成糊状，加5m
L-10m
l，含1%牛血清0.1
m
ol/LpH7.2
的
0.1
mol/I磷酸盐缓冲液，对研碎的组织作10倍稀释，制成组织悬液。
A2
全血样品可用含1%牛血清的。.1
m
ol/I磷酸盐缓冲液作
1:10
00倍稀释，制成悬液。
A3
如为污染物的样品，如粪便等用以上。.
1
mol/L磷酸盐缓冲液作10倍稀释，制成悬液。
A4
500r
/min离心5m
in,
A5
取500川加人有螺旋帽的离心管中，煮沸10
min
A6
用小型高速离心机以13
000
r/min离心5
min,
A了取10川、上清液用作PCR试验的样品DNA,
附
录
B
(标
准的附录)
电泳缓冲液的配制
B1
琼脂糖凝胶的TAE缓冲液(50倍)
三轻
甲
基
氨基甲烷碱(Trisb
ase)
2
42
g
冰
乙
酸
57.1
m
l.
0.5
m
ol
八(pH8.0
)乙二胺四乙酸(EDTA)
1
00
m
L
蒸馏
水
700m
l
待
上述
混
合物完全溶解后，加蒸馏水至10
00m
l，置4℃冰箱中备用，如配制2%的琼脂糖凝胶和
用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍成TAE缓冲液。
B2
2%琼脂格凝胶板制备
取
1g
琼
脂糖(电泳纯)加人至50m
LT
AE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，加人最终浓度为
0.5
y
g/ml一的滨化乙锭，用TAE定容至50m
L，冷却至60℃后，倒人凝胶板中，在距离底板。.5
m
m的
位置上放置梳子，以便加人琼脂糖后可以形成完好的加样孔子，凝胶的厚度为4
mm.待凝胶完全凝固
后，小心移去梳子，将凝胶板放人电泳槽中，加人恰好没过胶面约1
mm深的足量电泳缓冲液。
附
录
C
(标
准
的
附
录
)
酶联免疫吸附试验溶液配制
Cl
0.1
m
ol/L磷酸盐缓冲液的配制
将下列试剂按次序加人2
000
ml体积的容器中
氯化钠80.06
g
氯化钾
20.02
g
磷酸氢二钠
11.5
0g
Gs/"r
18648-2002
磷酸二氢钾
2.01
g
双蒸馏水800
ml,
混匀，用pH试纸调pH至7.2，用双蒸馏水定容至1
000
ml。
C2
底物溶液[邻苯二胺一过权化氢(OPD-H202)]
C2.1
0.1
m
ol/I.P
H5.0磷酸盐一柠檬酸盐缓冲液
将下
列
试
剂按次序加人10
00M
I，体积的容器中，充分溶解即成。
磷酸
氢
二
钠(Na,HPO,·12HzO)
71.
6
g
柠檬
酸
”.2g
蒸馏
水
10
00m
l,
C2.2
底物溶液
。.1
m
ol
凡
pH5.0
磷酸盐一柠檬酸盐缓冲液
100M
I.
邻苯
二
胺
(OPD)
40
m
g
30
(过
氧化氢)(H
,O,)
0.
15
m
l
此液
对
光
敏感，应避免强光直射。现配现用。
本文档由论文格式(http://www.csmayi.cn/)用户上传
非洲猪瘟检疫技术规范 本文关键词：猪瘟，非洲，检疫，技术规范
非洲猪瘟检疫技术规范 来源：网络整理
免责声明：本文仅限学习分享，如产生版权问题，请联系我们及时删除。
《
非洲猪瘟检疫技术规范》由：
76范文网互联网用户整理提供；
链接地址：http://www.yuan0.cn/a/58528.html
转载请保留,谢谢!
