论文-抗炎免疫药理实验方法的研究进展 本文简介：
新疆农业大学专业文献综述题目:抗炎免疫药理实验方法的研究进展.姓名:****·***.学院:食药学院.专业:药学.班级:药学142.学号:220142394.成绩：.指导教师:****·****.职称:副教授.2018年4月13日新疆农业大学教务处制抗炎免疫药理实验方法的研究进展****·***指导
论文-抗炎免疫药理实验方法的研究进展 本文内容：
新疆农业大学
专业文献综述
题
目:
抗炎免疫药理实验方法的研究进展
.
姓
名:
****·***
.
学
院:食药学院.
专
业:
药学.
班
级:
药学142.
学
号:220142394
.成
绩：
.指导教师:
****·****.
职称:
副教授
.
2018年4月13日
新疆农业大学教务处制抗炎免疫药理实验方法的研究进展
****·***
指导老师
****·****
摘要
越来越多的研究表明,炎症、免疫与神经内分泌系统密切相关,不可分割，抗炎免疫药理实验的研究方法不断更新,逐渐建立了一些适合不同药物的体内外研究模型,现在将从各个方面探究抗炎实验方法以及不同病理模型对抗炎免疫药物的反应其进展。
关键词：抗炎免疫实验方法，研究模型，进展
Research
progress
of
anti-inflammatory
and
immunological
pharmacological
experimental
methods
Elyer
Wblinstructor
Aygul
Ahmat
Abstract：
More
and
more
studies
show
that
inflammation,
immunity
and
neuroendocrine
system
are
closely
related
and
inseparable.
The
research
methods
of
anti-inflammatory
and
immunopharmacological
experiments
are
constantly
updated,
and
some
in
vitro
and
in
vivo
research
models
suitable
for
different
drugs
are
gradually
established.
Explore
the
progress
of
anti-inflammatory
experimental
methods
and
the
response
of
different
pathological
models
to
anti-inflammatory
immune
drugs.
Key
words
anti-inflammation
experimental
method,
research
model,
progress
抗炎免疫药理学是药理学一门新的分支学科,其主要研究的目的是探讨抗炎免疫药物的作用,作用机制及作用的规律性,寻找防治炎症免疫功能紊乱性疾病的有效药物,从而有助于揭示炎症免疫功能紊乱性疾病的病因和病理机制。随着免疫学、分子生物学、病理学等相关学科的迅速发展,抗炎免疫药理学领域的研究十分活跃,涉及面很广,研究内容越来越丰富,而多学科的相互渗透,使抗炎免疫药理实验方法学有了较大的进展,这无疑对抗炎免疫药理学的发展起了积极的推动作用。为此本文从整体动物模型和抗炎免疫药理实验两个方面,就近年来该领域的实验方法学中的某些主要进展作如下综述。
1动物模型
1.1小鼠自身免疫性肝炎模型
1988年朱芃芃[1-2]等报道了先用Ts细胞抑制剂刀豆蛋白A(ConA)及2’一去氧鸟普改变小鼠免疫状态,再用同系小鼠肝细胞膜特异性脂蛋白(LSP)免疫小鼠的方法较为成功的诱导出小鼠自身免疫性肝炎模型。我们在此基础上进行了改进,即用异品系小鼠LSP,并在免疫LSP的同时辅以弗氏完全佐剂(FCA),这样加重了肝脏病变,血清SGPT和血清抗LSP抗体滴度也显著升高,且成功率达100%。该模型在筛选、研究抗肝炎药物中起了非常重要的作用。
1.2
关节炎动物模型
大鼠佐剂性关节炎(adjuvant
arthritis)模型是一种T细胞介导的自身免疫性疾病模型,是研究抗炎免疫药物及治疗人类风湿性关节炎药物的理想的动物模型,已普遍受到人们的重视。季红等实验提示[3],
AA免疫反应高峰期脊髓背角及背根神经节SP含量增多,耗竭脊髓背角SP,细胞免疫功能更为亢进,
AA病情加重,人为增加脊髓背角SP含量,
AA大鼠免疫水平降低。推测AA大鼠免疫反应的同时也刺激了含SP的感觉神经末梢,使脊髓背角SP含量增多,通过未知通路向高级中枢神经传递信息,整合后产生某种反馈抑制,作用于免疫系统,使之不致于反应过强,而起到一定的自身保护作用。提示免疫调节肽SP,特别是脊髓背角SP参与AA鼠免疫系统的调节。为从神经免疫调节探讨AA以及多种自身免疫性疾病的发病机理,开发新型抗炎免疫药物提供了新思路。Ⅱ型胶原关节炎(collagentypeⅡinducedarthritis,
CⅡA)是Trentham等1977年首次建立的实验性关节炎模型。1980年代至90年代初期,国外大量重复,并在临床表现、病理组织学和免疫学等方面进行了广泛、深入的研究,使其不断成熟和完善。鸡、小牛、大鼠的Ⅱ型胶原均能引起关节炎。一般可在啮齿类动物和灵长类动物中产生[4]。本所先后用小鼠[5]、大鼠[6]成功地建立了CⅡA模型。CⅡA与AA有许多相似之处,但在免疫指标上也有不同。CⅡA的免疫功能变化兼有体液免疫和细胞免疫,动物体内存在针对自身CⅡ的高滴度IgG抗体,这些特性更接近人的类风湿性关节炎,因治此是筛选和研究治疗类风湿性关节炎药物的理想模型,也为今后研究人类与自身免疫有关的疾病提供了一个极有价值的实验模型。
1.3
系统性红斑狼疮动物模型
系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明,累及多个系统,病程迁延反复的自身免疫性疾病。多年来,理想的动物模型的缺乏一直是影响SLE研究的主要原因。自六十年代起,国内外学者逐渐建立一系列SLE病理模型,包括自发性和实验性两类[7]
自发性模型:
主要包括三种品系小鼠:NZB/NZWF1(B/W)、MRL/MP-lpr(MRL-lpr)和BXSB。NZB/NZWF1小鼠是NZB与NZW小鼠的杂交子代,可自发性出现免疫异常,主要表现为,
T、B细胞的过早发育与成熟,
B细胞多克隆激活,抗核抗体出现及免疫复合物性肾炎。MRL-Lpr小鼠的基因组合75%来自LG,
13%来自AKR,
12%为C3H,
0.3%为C57BL/6,
H-2单倍型为H-2K。该鼠能自发性形成免疫复合物性肾炎,血清中有大量的抗核抗体,淋巴组织高度增生。而BXSB小鼠是(C57BL/6JXSB/Le)
F1
,
其H-2单倍型为H-2b,可出现T、B细胞异常增生,胸腺萎缩,亦可产生大量自身抗体及免疫复合性肾炎,后期可并发严重关节炎。这些小鼠的共同特征是自发性出现一些类似于人SLE的症状及免疫学异常,T细胞亚群在免疫功能紊乱中起重要作用。但这些模型发病较晚、周期长,不易控制实验过程。
实验诱导SLE动物模型:
主要包括同种异体淋巴细胞诱导的小鼠SLE模型,空肠弯曲菌诱导的小鼠SLE模型、pristerne诱导小鼠SLE模型以及肽类及人抗DNA独特抗体诱导的SLE模型。这些模型共同的特点是:自身抗体出现较早,一般在再次免疫1～4周内,
1～2月内基本出现免疫复合物性肾炎等多器官慢性炎症表现,实验方法相对简单,而各模型各有特色。尽管上述模型与人类SLE还存在不少差距,但多种模型相互结合,为从不同侧面研究SLE的病理机制提供新途径。本所周玲玲[8]分别采用空肠弯曲菌CJ-S131和Pristane成功地建立SLE小鼠模型,并初步探讨了免疫调节药白芍总甙和褪黑素对SLE小鼠的双向免疫调节作用
1.4
免疫性肝损伤模型
目前对肝脏疾病的病理过程仍缺乏足够的认识。但肝内免疫反应已被公认为造成肝损伤的重要机制之一[9]。朱凡凡采用刀豆蛋白A(ConA)和2"-去氧鸟苷改变小鼠免疫状态,再用同系小鼠肝细胞膜特异性脂蛋白(LSP)免疫小鼠,诱导小鼠自身免疫性肝炎模型。我所陈学广等采用异品系小鼠LSP并在免疫LSP的同时辅以弗氏完全佐剂(FCA),使血清SGPT和LSP抗体滴度显著升高。近年来,先后建立了用异种血清,包括猪、牛、马血清,异体蛋白,包括猪白蛋白、血清球蛋白、人丙种球蛋白、人血白蛋白,
BCG+
LPS注射制作免疫肝纤维化病理模型。本所许建明[10]采用短小棒状杆菌+LPS序贯静脉注射建立免疫性肝损伤,该模型发病快,血SGPT在造模后16-18h达高峰水平,并伴肝脾明显肿大,血浆NO水平升高和脾细胞致分裂素反应明显下降的特点。为模拟临床肝炎的细胞免疫病理过程,徐强[11]等采用1%Picryl
chloriele(Pcl)乙醇溶液腹部涂药致敏[12],再用0.2%～
0.5%
Pcl的橄榄油溶液肝穿刺攻击,
18h后模型组血清转氨酶显著上升,肝组织坏死,炎性细胞浸润,甚至浸及整个肝脏。上述模型的建立,为肝损伤的机制及药效评价开辟了新的途径,但仍与病毒性肝炎免疫损伤所致的纤维化模型有相当大的差异。寻找新的、在免疫及病理学等方面相比更接近临床肝炎的动物模型仍是今后人们努力的方向。
1.5
神经免疫功能紊乱疾病的动物模型
近年来研究发现,神经系统部分疾病的发病机制和免疫功能紊乱有关[13]。已明确中枢神经脱髓鞘引起多发性硬化(multiplesclerosis,
MS)及周围神经脱髓鞘病格林-巴利综合症(GBS)等疾病与免疫功能有关。其中MS是以碱性髓鞘蛋白(myelinbasic
protein,
MBP)为自身抗原,
GBP则以周围神经髓鞘中P2蛋白为重要的抗原。实验性变态反应性脑脊髓膜炎和实验性变态反应性神经炎模型是人们研究神经免疫性疾病的常用模型。
实验性变态反应性脑脊髓膜炎(EAE)是研究MS的理想动物模型。其发病机理,临床体征及病理组织改变和MS相似,因此被广泛用于研究MS的发病机理和药物治疗作用的研究,而且近年来有重要的突破。多数学者认为,MS是一中枢神经系统的自身免疫性疾病,是体内CD4细胞对自身抗原一种免疫反应,主要的自身抗原包括MBP或MBP的多肽片段、含脂蛋白(proteinlipidprotein,
PLP)等在动物小鼠、大鼠及豚鼠均能诱发成功。采用牛MBP致敏SJL小鼠建立实验性变态反应性脑脊髓模型,分离EAE发病动物外周血对CD4特异的T淋巴细胞,用此种细胞静脉注入同种健康小鼠,可建立被动转移EAE模型。该模型可以更直接地用于研究EAE和MS的发病机理,及药物预防和治疗机理的研究。
实验性变态反应性神经炎模型(EAN)采用牛MBPP2蛋白加弗氏不完全佐剂,多点基础免疫7d后,同剂量加强免疫一次,一周后动物发病。主要动物为Lewis大鼠或兔。其主要表现:精神萎靡、体重下降,先出现双下肢无力,逐渐加重到瘫痪,随之发展到四肢瘫痪、四肢针刺反应减退。此种动物模型的发病机理、临床体征及组织病理与人类格林巴利综合征(GBS)相似,因此,
EAN作为GBS的动物模型已被国际所公认并广为应用。
2抗炎免疫药理实验
2.1鼠耳肿胀法
由同一未进行过本类实验操作的实验员进行地塞米松抗炎药实验[14]。将昆明种小白鼠20只随机分为两组:每组10只,雌雄各半。实验组腹腔注射地塞米松1.5mg·kg-1,
每日两次,
连续给药3d。对照组给予等容积的生理盐水。最后一次给药半小时后用微量进样器取二甲苯0.02mL/只,在小鼠右耳前后两面涂布,
每面各0.01mL;左耳不作任何处理。1h后,剪下双耳,用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片,电子天平称重。左右耳片重量差值为肿胀度。肿胀度抑制率=(给药组肿胀度-对照组肿胀度)/对照组肿胀度。将对照组与给药组的肿胀度进行统计学处理(SPSS9.0统计软件做t-检验)。实验重复四次:两次要求实验员均匀涂布致炎剂,
即取二甲苯0.02mL/只,右耳面前后各0.01mL,边推注二甲苯边匀速移动针头,
同时用针头涂抹二甲苯以使其涂布均匀(涂布组);另两次要求实验员取等量致炎剂后快速推注加样器,
使致炎剂快速滴到小鼠右耳前后面中点,
前后各0.01mL,
然后任致炎剂自行浸润扩散(推注组),
四次实验交叉进行,
得四组数据。
鼠耳肿胀法进行抗炎实验,
致炎剂的涂布是个十分关键的步骤,要求推注致炎剂的速度和针头移动的速度及范围要均匀一致,这对于初次接触该实验者来说,很难在短时间内迅速掌握技巧,从而影响了实验结果,甚至造成个别实验出现了相反的实验结果。采取定点快速推注的方法,可以使新手很快掌握实验的方法和技巧,从而提高实验的效率和准确性。
2.2角叉菜胶致大鼠足肿胀法
健康雄性大鼠50只,体重180～200g,随机分成5组,模型组、阳性对照药赖氨酸阿司匹林组、高热宁注射液高、中、低3个剂量组。在造模前,
高热宁注射液高、中、低3个剂量组提前连续给药3d,第4天,先分别测定各组大鼠右后肢足趾体积,接着高热宁注射液高、中、低3个剂量组分别给药,阳性对照组以注射用赖氨匹林给药、模型组腹腔注射0.9%氯化钠注射液,1h后,分别在各组大鼠右后肢足趾皮下注射0.1%角叉菜胶混悬液0.1ml,
致炎后1、2、3、4h分别测定足趾体积,以致炎后与致炎前足趾体积之差统计分析[15]
2.3
大白鼠足跖肿胀实验
选取健康大白鼠50只,雄性,体质量180~220g之间,随机分为空白对照高剂量中剂量低剂量和阳性对照5组,每组10只
禁食2h后灌胃给药
按体重计算其灌胃量,高,中,低剂量组。阳性对照组给予阿司匹林,空白对照组给予同等容积的生理盐水连续给药7天,末次给药后0.5h,从大鼠右后足跖中心向踝关节方向皮下注射10%卵蛋白液0.05ml/只,于致炎后0.5,1,2,3h
,分别采用排水法测定各鼠踝关节容积,连续3次，统计各组药物对大鼠足跖肿胀的影响,计算肿胀率,比较组间差异[16]
2.4
粘膜耐受实验研究方法
粘膜耐受[17](MT)
是指粘膜通过口服或鼻腔吸入等途径接触蛋白质抗原后,再用此种蛋白进行粘膜外免疫,引起的一种系统低反应状态。1911年Wells首次用公鸡卵白蛋白喂豚鼠,发现豚鼠对此种蛋白质引起的过敏具有抵抗性,Chase用二硝基氯苯喂豚鼠,发现豚鼠对二硝基氯苯的皮肤反应性降低。八十年代,口服耐受才应用到炎症免疫性疾病动物模型的治疗上.此外,研究发现,鼻腔给予蛋白也是一种有效诱导免疫耐受的研究的方法。粘膜耐受的机制较为复杂。一般认为小剂量抗原口服后,通过调节性T细胞分泌一些抑制性细胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10等,介导导主动抑制,大剂量口服或吸入后,抗原通过作用胸腺、脾脏及粘膜局部伴发的淋巴组织等处的Th1、Th2细胞,使其克隆无(cloneanergy)或克隆清除(clonedeletion)发挥免疫耐受作用。目前,通过口服Ⅱ型胶原可以明显抑制由Ⅱ型胶原诱导的大鼠或小鼠的关节炎;口服MBP可以对MBP诱导Lewis大鼠和SJL小鼠的EAE发挥明显治疗作用,通过口服耐受治疗其他免疫功能紊乱性疾病的研究正在国内外许多实验室进行,而且走在逐步应用临床。因此,MT的研究,对于炎症免疫性疾病的治疗提供了新的思路。
3
结语
炎症与免疫是机体的两种不同功能,但又密切相关不可分割,其相互之间的关系,错纵复杂。抗炎免疫药理学主要研究药物对炎症和免疫功能的作用及其机制,为炎症免疫性疾病的药物治疗提供理论基础。实践证明,多数抗炎免疫药物在发挥抗炎作用的同时,又影响机体的免疫功能,使机体异常的免疫状态(升高或降低)恢复,而对正常的免疫功能无明显影响;抗炎免疫药物多作用于炎症免疫功能的不同环节,但离不开机体神经内分泌系统内环境的相互影响,且不同品种、性别年龄的动物对抗炎免疫药物的反应可能不同。
因此,在进行抗炎免疫药理学研究时,应合理选择不同的抗炎实验方法,尤其注意要:正常与病理动物模型相结合;体内与体外实验互相补充;多种方法、多项指标综合评价。此外,还要注意选择敏感的实验动物。诚然,目前市场上出现相当多品种的抗炎免疫药物,但其临床应用效果远没有达到理想的水平。其主要原因是炎症免疫调节网络的复杂性,现行的抗炎免疫药理方法尚难以确切地评价其疗效。当今抗炎免疫药理学的研究在生物医学领域里,既是热点所在,亦面临着巨大的挑战,相信在未来的发展中将会有新的突破。
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