重症肌无力循环CD4 本文简介：
重症肌无力循环CD4+CXCR5+FOXP3+Tfr样细胞和CD4+CXCR5+FOXP3-Tfh样细胞失衡本研究显示MG患者循环Tfr样细胞的频率显着降低，Tfh样细胞频率增加。?Tfr样/Tfh样比率与MG患者的临床严重程度呈负相关。?糖皮质激素治疗可以恢复MG患者循环Tfr样/Tfh样细胞的失
重症肌无力循环CD4 本文内容：
重症肌无力循环CD4
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CXCR5
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FOXP3
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Tfr样细胞和CD4
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CXCR5
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FOXP3
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Tfh样细胞失衡
本研究显示MG患者循环Tfr样细胞的频率显着降低，Tfh样细胞频率增加。
?Tfr样/
Tfh样比率与MG患者的临床严重程度呈负相关。
?糖皮质激素治疗可以恢复MG患者循环Tfr样/
Tfh样细胞的失衡。
抽象
卵泡调节性T（Tfr）细胞被定义为调节性T细胞（Tregs）的特定子集，其用于控制??生发中心中滤泡辅助性T（Tfh）细胞和B细胞的过度活化。越来越多的证据表明，Tfr细胞或Tfh细胞的失调导致生发中心反应异常，这些反应有助于自身免疫疾病的发病机制。然而Tfr细胞和Tfh细胞在重症肌无力（MG）中的作用仍不清楚。该研究显示，与健康对照相比，MG患者外周血中CD4
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CXCR5
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FOXP3
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Tfr样细胞的频率显着降低，CD4
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CXCR5
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FOXP3
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Tfh样细胞的频率增加。此外，Tfr-喜欢/
Tfh样比例与MG患者的临床严重程度呈负相关。有趣的是，糖皮质激素（GC）治疗可以恢复循环Tfr样/
Tfh样不平衡细胞，这种恢复伴随着临床症状的减轻。这些结果首次表明，循环Tfr样和Tfh样细胞的不平衡可能参与免疫发病机制。MG可能为MG疗法的发展提供新的见解。
介绍
重症肌无力（MG）是一种自身免疫性疾病通常由针对骨骼肌的乙酰胆碱受体（AChR）或肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）的自身抗体引起[1]。
抗原特异性CD4
+
T细胞对于在称为生发中心反应的多步骤过程中产生高亲和力自身抗体和长寿浆细胞至关重要，从而在MG的发病机制中发挥关键作用。
CD4
+
T.根据细胞的独特转录因子表达，细胞因子产生和多种免疫功能，将细胞分为几个群体。
卵泡辅助T（Tfh）细胞是促进生发中心B细胞发育的子集之一，可促进体细胞高变，亲和力成熟和高亲和力抗体的产生，而调节性T细胞（Tregs）可起控制作用
B细胞反应并在建立自我耐受中发挥关键作用。
最近，卵泡调节性T（Tfr）细胞被定义为主要位于生发中心的Tregs的特化群体。
Tfr细胞与Tfh细胞具有共同的特征：两个亚型均表达CXCR5，CXCR5是通过趋化因子CXCL13的梯度将它们引导至B细胞区的受体。
另外，两个亚组均表达程序性死亡1（PD-1），ICOS和B细胞淋巴瘤6（Bcl6）。
然而，Tfr细胞被认为起源于胸腺来源的Treg前体可以通过FoxP3，CD25和GITR的表达与Tfh细胞区分开来。
Tfr细胞可抑制生发中心B和Tfh细胞的增殖，阻止自身免疫，从而与Tfh细胞在体液免疫调节发挥相反的作用。
不受控制的Tfr或Tfh活动可能导致免疫耐受失调和高水平自身抗体的异常产生，从而促进自身免疫反应的发展。
到目前为止，有限的研究已经探索了潜在的作用
Tfh细胞在MG发病机制中。
2005年，MG患者首次发现循环CD4
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CXCR5
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T细胞的频率增加，并且这种增加也与疾病严重程度正相关。进一步研究证实，与健康对照相比，MG患者循环Tfh细胞（定义为CD4
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CXCR5
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PD-1高和CD4
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CXCR5
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ICOS高）的频率增加。此外，胸腺Tfh细胞的表达也与MG的临床严重程度正相关。这些研究表明，Tfh细胞参与MG的异常免疫应答。此外，Tfr细胞缺陷已在实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）的淋巴结（LNs）中被描述，并伴有增加的Tfh细胞。有趣的是，全反式维甲酸（ATRA）治疗可以恢复Tfr细胞之间的不平衡，
LN中的Tfh细胞和T细胞的其他子集并且减弱EAMG症状。所有这些研究都表明Tfr
/
Tfh细胞失衡在MG发病机制中的关键作用。但是，到目前为止还没有任何报道MG患者循环Tfr细胞的频率，以及Tfr细胞的作用及其与其他T细胞亚群在MG异常免疫应答中的关系仍有待阐明。
在这项研究中，我们试图调查人口在MG患者中循环Tregs（定义为CD4
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CD25
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FOXP3
+），Tfr样细胞（定义为CD4
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CXCR5
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FOXP3
+）和Tfh样细胞（定义为CD4
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CXCR5
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FOXP3
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）。
我们发现与健康对照相比，MG患者外周血中Treg
/
Tfr样细胞的频率显着降低，Tfh样细胞的频率更高。
此外，Tfr样/
Tfh样比率是相反的与MG患者的临床严重程度相关。
最后，我们证明糖皮质激素（GC）治疗可以恢复Tfr样/
Tfh样细胞的不平衡，并且这种恢复伴随着临床症状减轻。
我们的结果表明循环Treg
/
Tfh样/
Tfr样细胞群的不平衡参与MG的发病机制并提供新的指标用于评估MG患者的新疗法的免疫状态和潜在目标。
2。材料和方法
2.1。耐心
共有79名MG患者从门诊招募2013年1月至2013年12月期间，从中南大学湘雅医院门诊招募了另外22名健康对照（HC）受试者。所有参与者在纳入研究之前签署了知情同意书。根据患者的病史和临??床表现诊断MG，包括易疲劳的肌肉无力波动，对胆碱酯酶抑制剂的阳性反应和/或反应减弱重复运动神经刺激和/或正单纤维肌电图。排除标准如下：患有其他自身免疫疾病的受试者，接受免疫抑制药物的患者，研究前的血浆置换或胸腺切除术，以及前4周的急性炎症患者。根据治疗策略将79名MG患者分为两组。
（1）治疗组：20例MG患者接受糖皮质激素（GCs）治疗研究;
（2）未治疗组：59名MG患者在研究前未接受GC治疗。接下来，建议13名未经治疗的患者从研究开始接受GC治疗，随访3个月。泼尼松通常以高剂量（每天0.75-1.0mg
/
kg）开始，然后剂量逐渐减少并维持在最低剂量需要达到最大效果（通常每天5-10毫克）很长一段时间。
MG患者的临床特征表1总结了这项研究。赫尔辛基宣言的行，并得到了人类的批准中南大学湘雅医院伦理委员会，中国长沙。
2.2。
MG患者的临床评价
我们设计了一个统一的登记表来收集详细的临床表来自MG患者的数据，并根据他们进行分类美国重症肌无力基金会的分类（MGFA）和定量重症肌无力评分（QMGs）。
2.3。样品
处理
三毫升静脉血直接收集到含肝素的管。然后，外周血单核细胞通过密度梯度离心分离（PBMC）
使用Ficoll-Paque
Plus（中国天津昊阳）并进一步用pH
7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次3小时
2.4。流式细胞术
人PBMC（1×10
6
/管）染色并孵育在室温下避光30分钟，用5升反抗身体鸡尾酒CD4-FITC，CD25-PE
/
Cy7和CXCR5-APC和同种型匹配的对照IgG抗体（eBioscience，USA）。下一个，
用PBS洗涤细胞两次并孵育45分钟在冰上用新鲜固定/透化溶液。洗完后用透化缓冲液两次，细胞用5μl染色PercpCy5.5-缀合的抗人FOXP3（eBioscience，USA）和同种型对照抗体并在冰上孵育50分钟。该然后通过流式细胞术分析染色的细胞。流式细胞仪设置和荧光补偿
使用BD
CompBeads和每个实验标准化BD
FACSDiva
Comp程序（BD
Immunocytometry
Systems）。每个样品至少分析50,000个事件。
FSC和SSC门设置为捕获目标细胞群，其中包括单核细胞和淋巴细胞，排除任何在关注CD4
+
T之前，将中性粒细胞和碎片染色细胞。随后，每个细胞群被识别并且用荧光表面标记物裂解。同种型对照是用于确定阳性细胞。阳性细胞的门允许血液CD4
+细胞中0.5％的阳性同种型对照，并且所有值都在CD4
+细胞上进行门控。
Treg，类似Tfr，和Tfh样细胞分别定义为CD4
+
CD25
+
FOXP3
+，CD4
+
CXCR5
+
FOXP3
+，CD4
+
CXCR5
+
FOXP3
-
细胞。
2.5。
统计分析
所有数据均表示为平均值±标准差除非另有说明，否则（SD）。
使用SPSS
19.0版软件，使用非配对t检验和Welch校正分析组间对之间的差异。
用单向ANOVA分析三组之间的差异。
使用Pearson相关系数测试评估变量对之间的关系。
Treg，Tfr样百分比的变化，GC处理前后的Tfh样细胞和样品用配对t检验解析。
低于0.05的P值被认为是显着的。
3.结果
3.1。循环Treg
/
Tfr样/
Tfh样细胞的不平衡
CD4
+
T.
MG患者的细胞与健康供者相比在这研究，未经治疗的MG患者（n
=
59），GC治疗的MG招募患者（n
=
20）和健康受试者（n
=
22）。那里在年龄或性别的分布上没有显着差异两组MG患者和HC组之间的差异（表格1）。首先，从中分离出CD4
+
T细胞群使用中描述的门控策略的其他细胞和碎片方法部分（图1a和b）。没有显着差异在获得的PBMC中观察到CD4
+
T细胞的频率来自MG患者和健康对照（数据未显示）。接下来，分析循环Treg
/
Tfr样/
Tfh样细胞的频率通过流式细胞术，代表性的点图和相关的自发同种型对照如图1c-h所示。关系到健康的捐赠者，我们发现频率明显较低周围的CD4
+
CD25
+
FOXP3
+
Tregs（CXCR5
+加上CXCR5
-
）未经治疗的MG患者的血液，但未经GC处理患者（图1d，e和i）。这些结果证实了这种不平衡MG患者中循环Tregs的表现之前的学习。而且，我们发现百分比显着降低CD4
+
CXCR5
+
FOXP3
+
Tfr样细胞的年龄和更高的百分比CD4
+
CXCR5
+
FOXP3
-
Tfh样细胞在外周血中的表达未治疗的MG患者与MG患者相比经过GC治疗和健康受试者（图1g，h，j和k）。因此，Tfr样/
Tfh样比率降低在未治疗的MG患者中观察到与其他患者相比两组（图1l）。总的来说，这些数据提供了证据MG中循环Treg
/
Tfr样/
Tfh样细胞的不平衡P
<0.01）。因此，Tfr样/
Tfh样比率是负面的（图2d，r
=
-0.636，P
<0.01）。这些结果表明Treg，Tfr样和Treg的循环水平Tfh样细胞与MG的临床进展密切相关和从而为预测提供了新的候选标记的发展MG和MG患者的预后。
3.3。比较循环Treg，Tfr样的百分比，和眼部MG（OMG）患者之间的Tfh样细胞和广义MG（GMG）患者鉴于两种临床表现的轻微异质OMG和GMG之间的免疫机制，我们试图确定循环中的潜在差异未经处理的OMG之间的Treg，Tfr样和Tfh样细胞水平患者（n
=
27）和未治疗的GMG患者（n
=
32）。虽然两组间的Tregs没有显着差异（图3a），显着循环Tfr样细胞水平降低并且观察到升高水平的循环Tfh样细胞GMG患者与OMG患者相比（图3b和
C）。因此，Tfr样/
Tfh样比例显着降低GMG组（图3d）揭示了免疫的异质性MG发病机制失调。
3.4。性别对循环Treg，Tfr样或Tfh样没有影响MG患者的细胞因为MG在女性中比男性更普遍，我们检查性别是否影响循环Treg的分布，未治疗的MG患者中的Tfr样和Tfh样细胞。然而，我们没有发现环流水平有任何显着差异雄性（n
=
22）和雄性之间的Treg样细胞或Tfh细胞女性（n
=
35）MG患者（图4）。
3.5。
GC处理恢复了循环Treg的不平衡，MG患者中的Tfr样和Tfh样细胞。
作为MG最常用的免疫定向疗法，GC可以起到恢复T细胞免疫失调和使MG患者的Treg水平正常化的作用[13,14]。
为了进一步研究GC治疗对Tfr样和Tfh样细胞的潜在影响，我们检查了在研究前未接受GC治疗的13名MG患者中Treg，Tfr样和Tfh样细胞的动态变化。
但由于与疾病有关的原因，建议接受这种治疗。
GC治疗3个月后，肌无力所有这些患者的症状均减弱（图5d）。此外，我们发现循环Treg和Tfr样细胞的频率增加，并且这些患者中循环Tfh样细胞的频率降低（图5a-c）。
总的来说，我们的结果表明GC治疗可以通过恢复循环Treg，Tfrlike和Tfh样细胞之间的不平衡并维持免疫稳态来减轻MG患者的临床症状。
讨论
在这项研究中，我们提出了不平衡的有力证据在MG患者中循环Treg，Tfr样和Tfh样细胞之间以及GC治疗后这些不平衡的逆转。与先前的研究一致，我们确认了在MG中循环CD4
+
CD25
+
FOXP3
+
Treg细胞数的效率患者和GC缺乏症的正常化APY。然而，其他一些研究未能证明MG患者的循环Tregs减少]。一种可能造成这种失败的原因是选择了不同的Treg关联用于定义细胞系的分子。根据最近的研究
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CD4
+
CD25
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T细胞可能过高估计CD4
+
CD25
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FOXP3
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Treg细胞水平，而CD4
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CD25高T细胞倾向于低估这些水平。即使是CD4
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CD25
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CD127低/
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T细胞也可能失败表示CD4
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CD25
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FOXP3
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Treg细胞的精确群体。综合起来，我们的结果进一步证实了这一点循环Tregs的缺乏涉及发病机制MG。越来越多的证据表明人口众多CD4
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CXCR5
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T细胞在人外周血中的表达诱导幼稚B细胞分化为质粒的能力母细胞和促进抗体的产生。因此血CD4
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CXCR5
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T细胞可代表循环反部分记忆Tfh细胞在一定程度上。在这项研究中，CD4
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CXCR5
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T细胞被分为两个子集，即CD4
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CXCR5
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FOXP3
+细胞和CD4
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CXCR5
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FOXP3
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细胞，其中分别代表循环的Tfr样细胞和Tfh样细胞。根据之前的研究，我们发现有所增加未经治疗的MG患者和患者中循环Tfh样细胞的频率这种疾病活动增加的密切相关性。有趣的是，与其他恶魔的结果一致
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联合治疗（胸腺切除加GC）可以正常化MG患者CD4
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CXCR5
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T细胞频率[8]，我们进一步恶魔
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并指出单独接受GC的患者也表现出来恢复的CD4
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CXCR5
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FOXP3
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T细胞的频率除了减弱疾病活动。总的来说，我们的结果表明了这一点循环的Tfh样细胞的扩增可以被认为是aMG的潜在活动指数和治疗目标。最近将Tfr细胞定义为不同的Treg群体通过抑制Tfh特异性控制GC反应的细胞和B细胞。
Tfr细胞和Tfh细胞已成熟生发中心反应的局部和拮抗调节因子。该据报道，Tfr细胞的失调导致了这种情况的发生许多自身免疫性疾病的发展，包括多种疾病硬化和EAMG
。在目前的研究中，我们疗法探讨了Tfr样细胞在患者中的潜在作用MG。我们提出了有关循环不足的有力证据未经治疗的MG患者的Tfr样细胞及其逆转GC治疗后的效果。另外，我们演示了第一次，循环Tfr样细胞水平下降降低Tfr样/
Tfh样比率与更大的差异密切相关缓解MG患者的活动。总之，这些结果表明Treg，Tfr样和Tfh样细胞的不平衡有助于MG的免疫发病机制因此可以作为一种潜力治疗目标和预后的有意义工具。以前的研究已经证明循环Tfr细胞和Tfh细胞表现出较低的滤泡标志物表达和a缺乏高水平的Bcl-6和ICOS的表达比较与LNs中发现的效应Tfr细胞和Tfh细胞。另外，循环Tfr细胞比LN
Tfr抑制性更小细胞和循环Tfh细胞比LN效应细胞Tfh更有效细胞。然而，循环Tfr细胞和Tfh细胞仍然提供研究生发中心改变的有效替代方案在自身免疫疾病的背景下的反应。所以，需要额外的工作来进行Tfr细胞的组合分析来自MG患者的外周血和LN的Tfh细胞和Tfh细胞
确定改变的潜在机制在Tfr细胞和Tfh细胞中有助于MG的进展。MG通常分为两种不同的类型，即OMG和GMG，根据不同的表现形式。
GMG患者有据报道，CD4
+
CXCR5
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T细胞频率更高比OMG患者[8]。我们进一步透露了GMG患者表现出显着更大的CD4
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CXCR5
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FOXP3-Tfh样细胞频率和较低的CD4
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CXCR5
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FOXP3
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Tfr样细胞频率与OMG患者相比，这提示异常MG的免疫发病机制的基因和复杂性。最后，因为女性比男性更频繁地发展MG，
和雌激素给药可以促进AChR特异性CD4
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T细胞扩大，这增加了EAMG小鼠的严重程度，我们假设性别可能会影响流通的分布MG患者中的Treg，Tfr样和Tfh样细胞。但是，我们的结果透露，性别不影响循环Treg，Tfr样的水平和MG患者中的Tfh样细胞。然而，这项研究有一些局限性，其中包括一个小的样本量，短暂的随访时间和不完整的数据自身抗体水平，包括AchR-Ab和Musk-Ab。因此，进一步纵向研究不同的T细胞亚群ger人群是有保证的。更重要的是，就业的其他分子标记（即PD-1和ICOS）可能有所帮助更准确地定义循环滤泡样CD4
+
T细胞[22,23]。最后，体外功能研究将有助于我们了解MG中Tfr细胞和Tfh细胞的失调患者并为这种疾病提供更有效的治疗。总之，这是第一份展示的报告MG患者中循环Tfr样细胞的缺乏和GC治疗3个月后出现这种缺陷的恶化。此外，本文还证实了Tregs的短缺以及MG外周血中Tfh样细胞的扩增患者，可在GC治疗3个月后获救。最后，Treg，Tfr样和Tfh样细胞的不平衡密切相关MG中的疾病活动因此可以被认为是代表性的临床生物标志物。进一步研究病理生理学作用T细胞亚群可以为MG提供潜在的治疗靶标。
图1.与健康供体相比，来自MG患者的CD4
+
T细胞中循环Treg，Tfr样和Tfh样细胞的流式细胞术分析。外周血单个核细胞获得来自59名未治疗的MG患者，20名GC治疗的MG患者和22名健康对照受试者通过流式细胞术分析。淋巴细胞门控指示然后设置FSC-A和SSC-A（a）的区域，然后设置CD4
+
T细胞以从分析中排除污染的单核细胞（b）。我们使用同种型对照来确定该阳性细胞（c和f）。
CD4
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CD25
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Foxp3
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Tregs的代表性流式细胞仪图显示在右上角（d和e）。
CD4
+
CXCR5
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Foxp3
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Tfh样细胞CD4
+
CXCR5
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Foxp3
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Tfr样细胞如下所示（g和h）。所有细胞都在CD4
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T细胞上门控。箱形图显示循环Tregs的百分比为
显著未治疗的MG患者比GC治疗的MG患者和健康供者（i）低。显着较低的Tfr样细胞百分比和更高百分比与GC治疗的MG患者和健康受试者（j和k）相比，在未治疗的MG患者的外周血中观察到Tfh样细胞。该与其他两组（1）中的比例相比，未治疗的MG患者的Tfr样/
Tfh样比率降低。
FSC：前向散射;
SSC：侧面散射。在上面箱和晶须图中，方框的底部和顶部分别代表第一和第三四分位数，方框内的条带表示中位数和底部和顶部胡须分别代表最小值和最大值。
图2.循环Treg，Tfr样和Tfh样细胞的频率与MG患者临床严重程度的相关性分析。潜在的相关性该循环Treg，Tfr样频率用Spearman相关性检验分析具有MG患者QMG的Tfh样细胞。每个数据点代表个人主题;循环Tregs和Tfr样细胞的频率与QMG（a和c）呈负相关。循环Tfh样细胞的频率是与QMG正相关（b）。
Tfr样/
Tfh样比率与QMG（d）呈负相关。
图3.比较OMG和GMG患者中循环Treg，Tfr样和Tfh样细胞的百分比。来自未治疗的OMG患者的PBMC（n
=
27）和通过流式细胞术分析未治疗的GMG患者（n
=
32）。两组之间的Tregs没有显着差异（a）。有一个重要的减少与OMG患者（b和c）相比，GMG患者循环Tfr样细胞和循环Tfh样细胞升高。类似Tfr
/
Tfh的比率是与OMG组相比，GMG组显着降低（d）。
图4.性别对未治疗的MG患者的循环Treg，Tfr样和Tfh样细胞的影响的研究。
循环中没有显着差异男性（M，n
=
22）和女性（F，n
=
37）患者之间的Treg，Tfr样或Tfh样细胞
图5.GC治疗恢复了未治疗的MG患者中循环Treg，Tfr样和Tfh样细胞的不平衡。循环Treg，Tfr样和TFH样细胞在通过流式细胞术分析在GC治疗3个月之前和之后的MG患者。
Treg和Tfr样细胞的频率增加（a和b），而Tfh样细胞的频率下降（c）。
GC治疗3个月后，所有13名MG患者的QMG均下降（d）。
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