TET1过表达对宫颈癌细胞的影响 本文关键词：癌细胞，宫颈，表达，影响，TET1
TET1过表达对宫颈癌细胞的影响 本文简介：摘要：目的通过对HeLa细胞过表达TET1基因，探究TETI基因对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响。方法采用TALE-VP64系统构建TET1过表达质粒，转染宫颈癌HeLa细胞，四哩盐(MTT)比色法监测细胞增殖状况，划痕试验检测细胞迁移能力的变化，Transwell试验检测HeLa细胞侵袭能力的变化。
TET1过表达对宫颈癌细胞的影响 本文内容：
摘要：目的通过对HeLa细胞过表达TET1基因，探究TETI基因对宫颈癌细胞增殖迁移能力的影响。方法采用TALE-VP64系统构建TET1过表达质粒，转染宫颈癌HeLa细胞，四哩盐(MTT)比色法监测细胞增殖状况，划痕试验检测细胞迁移能力的变化，Transwell试验检测HeLa细胞侵袭能力的变化。结果MTT法检测HeLa细胞增殖状况，TET1过表达的Clone1和Clone2细胞增殖能力明显弱于野生型HeLa细胞(P<0.OS)oTranswell试验检测TET1过表达Clone1及Clone2HeLa细胞穿过magtrigel胶及小室的数量分别是(21士5)和(22士6)个/视野，而野生型HeLa细胞组为(38士7)个/视野，与野生型HeLa细胞组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。划痕试验检测TETI过表达组(Clone1}Clone2)细胞和野生型HeLa组细胞24h及48h的迁移率，后者明显高于前者(P<0.01)oTET1过表达能够抑制HeLa细胞的增殖、侵袭、迁移等能力。结论TET1基因过表达对宫颈癌HeLa细胞有抑癌基因的作用。
关键词：TETI;宫颈癌;侵袭;增殖
宫颈癌在女性中高发，是常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的生命健康川。早期研究认为人类乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染是宫颈癌的主要致病因素之一，近年来，多项研究表明，宫颈癌细胞表观遗传学的改变是影响其发生及演进的重要因素[z1TET1作为体内一种加氧酶，具有高效催化5一甲基胞嚓咤}5-ma)转化为5-经甲基胞嚓咤}5-hma)的作用[’1。TET1在多种恶性肿瘤组织中低表达，如前列腺癌、肺癌、膀胧癌、肝癌，具有明显的去甲基化作用[4}。研究[5}表明，TET1的表达水平与肿瘤的侵袭和转移密切相关，而且TETl表达水平的下调可以活化致癌基因，促进肿瘤细胞增殖，促进肿瘤发生和转移。该研究拟通过构建TETl过表达HeLa细胞，通过细胞增殖试验、划痕试验、Transwell试验检测其增殖、侵袭、迁移等能力的变化，探究TETl过表达对官颈癌细胞生物学行为的影响。
1材料与方法
1.1材料1.1.1质粒p57TALE-VP64过表达质粒购于上海泰冷生物技术有限公司。1.1.2细胞选用人宫颈癌细胞系HeLa细胞系(胚胎干细胞研究湖北省重点实验室保存)。1.1.3主要试剂DMEM高糖培养基(美国Gib-co,11965-092)、胎牛血清(美国，Gibco公司，10099-141);Lipo3000转染试剂(美国ThermoFisher公司，L3000001);Transwell小室(美国Corning公司，3422);TETl抗体(美国AvivaSystemsBiology公司，OAAB19195);小鼠抗人GAPDH抗体(AF0006)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)、四哩盐(thiazolylbluetetrazoliumbromide，MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、BeyoECLStar(特超敏ECL化学发光试剂盒，P0018AS，上海碧云天生物技术公司)。1.2方法1.2.1细胞培养HeLa细胞置于5%COZ,37℃J恒温培养箱中培养，完全培养基配制:90%DMEM培养基+10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)。1.2.2TET1过表达质粒构建根据转录激活样效应因子(transcriptionactivator-likeeffectors,TALE)设计原则，选取TETl启动子区不同区域设计6条TALE臂，根据TALE臂碱基序列，将相应的模块与骨架载体进行连接，转化后挑取菌落培养，提取质粒，选出序列正确的质粒进行后续细胞转染。1.2.3细胞转染选取生长状态良好的HeLa细胞，计数后接种至6孔板内，调节细胞密度至lx105/ml，培养过夜。次日进行转染，取2支灭菌的1.5ml离心管，1管加人TALE-VP64-TETl质粒2}g，优化培养基(opti-minimaessentialmedium,Opti-MEM)50闪，轻轻吹打混匀;另1管加人2闪Lipo-fectamine3000和50}.},1Opti-MEM培养基，轻轻吹打混匀，室温孵育5min。将两管液体混合，室温下温育5min，最后将转染复合物均匀滴加到待转染的细胞培养板中。转染24h后，用漂吟霉素筛选稳转株，待细胞长到一定密度后检测过表达效率。1.2.4细胞增殖试验取野生型和过表达型HeLa细胞，接种至%孔板内，每孔200闪完全培养基，细胞密度1x104/ml，每组5个重复，置于37℃恒温培养箱内培养。于培养第1,3,5,7天进行MTT检测。1.2.5划痕试验取野生型和过表达型HeLa细胞，计数后调整细胞密度至0.5x106/ml，接种至12孔板内，37℃培养箱内恒温培养。划痕前1天晚上将培养液换为DMEM无血清培养基培养。次日用小枪头在培养皿底划出水平划痕，用PBS洗去多余的细胞，继续用DMEM无血清培养基培养细胞。分别在划后0,24,48h拍照记录。1.2.6Transwell试验将DMEM基础培养基和Matrigel胶按5:1的比例稀释，以50},1/孔的浓度均匀铺在Transwell小室上室内，37℃静置2h，使Matrigel胶凝固。取不同TET1基因型HeLa细胞，计数后调整细胞密度到1x106/ml。向上室加人100闪/孔细胞悬液，下室内每孔加人500闪/孔DMEM完全培养基。培养48h后取出小室，加人4%多聚甲醛室温固定30min,PBS充分水洗，1%结晶紫染液室温染色15min,PBS充分水洗，擦去上室中的Matrigel胶及细胞，显微镜下观察拍照。1.2.7Westernblot提取不同组别HeLa细胞总蛋白，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropho-resin,SDS-PACE)电泳。15V恒压转膜1h,5%脱脂奶粉室温封闭1h，加人一抗(TET1，稀释度1:500;GAPDH，稀释度1:1000),40C摇床过夜，洗涤缓冲液(trisbufferedsalinetween,TEST)洗膜后，加人辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠二抗，室温孵育1h,TBST洗膜后显影。1.3统计学处理使用GriphpidPrism5.0进行统计学分析。计量资料结果以x士‘表示。细胞增殖试验、划痕试验、Trinswell侵袭试验结果的比较采用t检验，P<0.OS示差异有统计学意义。
2结果
2.1TETl过表达质粒的构建和鉴定因为TETl的CDS序列比较长，常规的克隆方法存在困难，采用TALE特异性识别并结合靶基因的启动子，再与VP64增强子结合，从而增强靶基因的表达(图1A)0本研究中，针对TETl启动子区域，共选择了6个靶位点。将构建成功并测序正确的质粒转染293细胞，通过效率检测最终确定2号(TALE靶序列为转录起始位点上游一231至一216)质粒用于后续实验。将2号质粒转染HeLi细胞后，漂吟霉素筛选10d，最后采用反转录·聚合酶链反应(reversetranscription-polymerisechainreaction，RT-PCR)及Westernblot检测TET1过表达效率，发现有2个克隆(Clone1,Clone2)稳定的过表达TETl(图1B),并将这2个克隆用于后续实验。2.2TET1过表达对HeLa细胞增殖能力的影响为了检测TETl过表达对HeLi细胞增殖能力的影响，本研究采用MTT检测HeLi细胞增殖状况。连续监测7d后，得到3组细胞的增殖曲线(图2),TETl过表达的Clone1和Clone2细胞增殖能力明显弱于野生型HeLa细胞(t,,}YS=2.6,t,,}Y}-3.03,P<0.OS)。2.3TETl过表达HeLa细胞侵袭能力的影响对过表达TETl的HeLa细胞，采用Transwell侵袭试验检测其侵袭能力的变化情况。如图3所示，Tran-swell小室培养48h后，Clone1及Clone2穿过magtrigel胶及小室的细胞分别是(2115)和(2216)个/视野，而野生型细胞组为(3817)个/视野，与野生型细胞组比较，差异有统计学意义(P<O.OS,t值分别为4.42和3.88)。结果显示，过表达TETl明显降低了HeLa细胞的侵袭能力。2.4TET1过表达对HeLa细胞迁移能力的影响划痕试验是判断细胞迁移能力的经典试验。本研究采用划痕试验检测TET1过表达对HeLa细胞迁移能力的影响。结果表明，TETl过表达组(Clone1,Clone2)细胞24h及48h的迁移率分别为(17.4813.12)%、(18.2313.57)%及(51.6816.35)%、(53.2517.16)%，而野生型HeLa组细胞24h及48h的迁移率分别为(29.6814.63)%及(75.8318.42)%，后者明显高于前者(P<0.01,24ht值分别为2.75,2.68,48ht值分别为4.25,3.78)，见图4。
3讨论
TET1是TET家族最重要的成员之一，属于含有。一酮戊二酸及FeZ+的双加氧酶f}l。TETl能够催化5-mC转化为5-hmC，进而转化为5一甲酞胞嚓咤和5-竣基胞嚓咤，从而实现DNA去甲基化，发挥生物学效应[0。许多肿瘤中存在自噬相关调节基因的甲基化异常现象，TET1作为一种新的去甲基化转录因子，在多种疾病具有重要的调控作用。研究发现TET1具有抑癌作用[A}，在肺癌f91、结肠癌f}}l、乳腺癌fttl组织中，TET1表达明显减少。多项成瘤实验表明，如果TET1低水平表达，那么肿瘤细胞侵袭性增强，生长速度加快，癌细胞更易转移;若TET1过表达，肿瘤细胞的侵袭性明显降低，异种移植瘤的生长受到抑制。最新的研究发现，TET1可以通过促进Wnt通路拮抗剂肿瘤抑制因子p一连环蛋白抑制基因2和分泌型卷曲相关蛋白2的DNA去甲基化，抑制Wnt/catenin信号通路，在鼻咽癌中发挥抗肿瘤能力[}z味还可以通过抑制分泌性蛋白Dikkopf-1及SFRP2从而抑制卵巢癌细胞上皮间质转化[},}。综上，TETl的低水平表达与肿瘤的侵袭、转移密切相关。对TETl与宫颈癌细胞生物学行为的影响的研究，必将对宫颈癌的早期诊断、预后及治疗具有重要意义。TALE是一种具有高度特异性的调节基因。由多个串联的氨基酸重复序列构成DNA结合域，一个重复序列通常可以识别一个特定碱基。根据靶基因特异的碱基序列，将相应的功能模块连接在一起，构成识别该特异核酸序列的TALE蛋白分子。TALE蛋白分子具有很高的特异性，因为即便有2个碱基错配，也不能被TALE识别。在分子生物学领域中，如果将特异的DNA结合域与蛋白的功能结构域(比如核酸酶、增强子等)连接后导人细胞，就可以影响细胞相应基因的表达[川。前期研究[l5}表明，TETl基因敲除的宫颈癌He-La细胞增殖能力、侵袭能力增强，TET1基因敲除能增加宫颈癌HeLa细胞的恶性行为。为探讨TETl基因过表达的HeLa细胞生物学行为的影响，本研究采用TALE-VP64系统构建TETl过表达质粒，再将其转染人HeLa细胞，得到了2个TET1过表达的单克隆HeLa细胞。分别用MTT法、Transwell侵袭试验、划痕试验检测不同组别HeLa细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化情况。与野生型HeLa细胞相比，TETl基因过表达的HeLa细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显降低。本研究表明TETl基因过表达对宫颈癌HeLa细胞有抑癌基因的作用，这一结果与TETl基因在其他肿瘤疾病中的作用类似，将为治疗宫颈癌提供新的作用靶点。本研究结果与前期研究结果相互印证，证明了TETl基因对HeLa细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为具有重要的调控作用，为研究TET1的作用机制及宫颈癌的靶向治疗提供了理论基础，但具体的分子机制需要进一步研究。后续研究将会探讨TET1基因调控宫颈癌恶性行为的具体机制，以期为}}h"m床治疗宫颈癌提供新的治疗方案。
作者：周君阳 于莉 陈秀英 成健 罗心霞 王环 黄宽明 朱名安 丁妍
TET1过表达对宫颈癌细胞的影响 来源：网络整理
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