猪乙型脑炎病毒疫苗种类与研发情况 本文关键词：脑炎，疫苗，种类，研发，病毒
猪乙型脑炎病毒疫苗种类与研发情况 本文简介：摘要： 猪乙型脑炎(Japaneseencephalitis,JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种经蚊虫传播的人畜共患病,且是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是JEV的重要储存宿主和扩增宿主,同时也是乙型脑炎的主要传染源,可引起母猪繁殖障碍和公猪睾丸炎。人是JEV的终末宿主,
猪乙型脑炎病毒疫苗种类与研发情况 本文内容：
摘 要： 猪乙型脑炎 (Japanese encephalitis, JE) 是由乙型脑炎病毒 (JEV) 引起的一种经蚊虫传播的人畜共患病, 且是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病。猪是JEV的重要储存宿主和扩增宿主, 同时也是乙型脑炎的主要传染源, 可引起母猪繁殖障碍和公猪睾丸炎。人是JEV的终末宿主, 特别是儿童, 感染发病后, 死亡率可达25%。目前, 仍无有效药物治疗乙型脑炎感染, 而其流行区域的扩大及其优势基因型的改变为JEV防控策略带来了新的挑战。近年来, 随着基因工程和蛋白质工程的发展, 以及对病毒分子结构和功能的深入研究, 一些新技术新手段被应用到JEV疫苗研发中, 基因工程亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、嵌合病毒减毒活疫苗、多表位疫苗、DNA疫苗等应运而生。在疫苗制备过程中, 培养工艺的优化、病毒抗原的纯化、新型佐剂和耐热保护剂的应用等生产工艺的提升策略, 为保障JEV疫苗的质量提供了新方向。文章简述了猪JEV疫苗的使用现状及研发进展, 旨在为研制更安全、有效的猪JEV疫苗提供参考依据。
关键词： 乙型脑炎病毒; 灭活疫苗; 活疫苗; 猪; 病毒样颗粒; 基因工程疫苗;
Abstract： Japanese encephalitis (JE) is an acute zoonosis, and has the characteristic of infectious diseases in the central neural system (CNS) , which caused by Japanese encephalitis virus (JEV) and transmitted by mosquitoes.The pigs are important storage and increase host of JEV, and it was main origin of infection.JEV can cause pregnant sow abortion and boar testitis.Humans are the terminal host of JEV, especially children, and the mortality rate can reach 25% after infection.There are still no effective drugs for JEV.The expansions of the epidemic area of JE and the changes of dominant genotypes have brought new challenges to the prevention and control strategies of JEV.In recent years, with the development of genetic and protein engineering, as well as the researches on the molecular structure and function of viruses, more and more new technologies and methods have been applied to the researches of vaccine for JEV.As a result, genetically engineered subunit vaccine, virus-like particle vaccine, chimeric virus attenuated live vaccine, polypeptide vaccine and DNA vaccine have emerged at the historic moment.In the process of vaccine preparation, the production process of optimizing the culture mode, purifying virus antigen, applying new adjuvant and heat resistant protective agents are expected to provide a new research direction for improving the quality of JEV vaccine.The present situation and development of swine encephalitis vaccine strain were reviewed in this paper to provide references for the development of safer and more effective vaccines against JEV.
Keyword： Japanese encephalitis virus (JEV) ; inactivated vaccine; live-attenuated vaccine; swine; virus-like particles; genetically engineered vaccine;
猪乙型脑炎 (Japanese encephalitis, JE) 是由黄病毒科 (Flaviridae) 黄病毒属 (Flavivirus) 乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus, JEV) 引起的可经蚊虫传播的中枢神经系统感染急性人畜共患传染病[1]。JEV在蚊子和脊椎动物宿主 (特别是猪) 中呈地方性传播。JEV感染可引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎, 公猪睾丸炎等, 人感染后 (尤其是儿童) 可引发严重的中枢神经系统疾病甚至是急性致死脑炎, 死亡率可达25%。库蚊是JEV主要的传播媒介, 猪是其主要的储存宿主、扩增宿主和传染源, 通常可形成“猪-蚊-人”的循环传播模式。由于目前尚无治疗乙型脑炎的有效办法, 接种疫苗仍是控制JEV的主要方式, 而猪在JEV的传播中发挥着重要的作用, 因此研发有效的猪用JEV疫苗是切断其向人传播的有效策略[2]。作者对猪乙型脑炎疫苗毒株的使用现状、研发进展等方面进行了分析总结, 以期为研制更安全、有效的猪JEV疫苗提供参考依据。
1、 国内外JEV疫苗毒株使用现状
JEV共有5个基因型:基因Ⅰ～Ⅴ型, 分布具有区域性。印度尼西亚、马来西亚地区5个基因型都有分布;澳大利亚、新几内亚地区主要存在基因Ⅰ、Ⅱ型;中国台湾、菲律宾地区存在基因Ⅱ、Ⅲ型;泰国、柬埔寨、越南地区存在基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型;日本、韩国、中国存在基因Ⅰ、Ⅲ型;印度、斯里兰卡、尼泊尔地区存在基因Ⅲ型;东亚和南亚的亚洲大陆上存在基因Ⅴ型。目前所有可用的疫苗毒株主要有:Nakayama株、SA14-14-2株、Beijing-3 (P3) 、Beijing-1 (P1) 株等, 均为JEV基因Ⅲ型[3]。
Nakayama株 (中山株) 1935年于日本分离自一名患者脑组织中[3], 在鼠脑中连续传代, 在小鼠模型上可提供对多个JEV的攻毒保护, 是生产鼠脑灭活疫苗的主要疫苗株。Beijing-1 (P1) 株1949年于北京分离于病人脑组织中, 较Nakayama株可产生更广泛的抗体反应。Beijing-3 (P3) 株1949年分离于患脑炎死者的脑组织中, 具有对小鼠毒力强, 免疫原性广, 可产生更广泛的抗体反应等特点。SA14-14-2株1954年于西安分离自三带喙库蚊幼虫体内, 将其第11代鼠脑病毒在原代地鼠肾细胞连续传100代, 经多次蚀斑克隆纯化, 获得1株在小鼠脑内传5代的稳定株5-3株, 后将该毒株进一步通过乳鼠皮下传代5次, 再克隆2次后得到, 具有对小鼠无致病力, 基因型高度稳定, 免疫原性好等特点。
2、 JEV疫苗种类
目前, 已有4种不同类型的JEV疫苗:鼠脑灭活疫苗、细胞培养灭活疫苗、细胞培养减毒活疫苗和基因工程减毒活疫苗。兽用乙脑疫苗主要为鼠脑灭活疫苗和地鼠肾细胞乙脑活疫苗。
2.1、 鼠脑灭活疫苗
JEV灭活疫苗在20世纪30年代开始研制, 首个批准的鼠JEV灭活疫苗是日本Biken公司生产的JE-VAX?[4], 该疫苗使用Nakayama毒株, 甲醛灭活。
由感染JEV P1株系的鼠脑组织制备的灭活疫苗抗原产量高, 可诱导中和抗体应答, 而后在疫苗生产中由P1株取代了Nakayama株。现在除日本外其他亚洲国家, 如印度、泰国、韩国、越南也小量生产这种疫苗。但由于该疫苗价格较高, 且时有不良反应发生, 因此未能大规模使用。
1950～1951年, 中国卫生部北京生物制品研究所研制的鼠脑组织JEV毒株为P1株, 1952～1959年间推广使用。1968年改用转瓶培养地鼠肾细胞成致密单层后接种P3株, 37 ℃培养2 d或32 ℃培养3 d, 收获病毒, 此法生产的疫苗安全性和免疫原性都明显提高, 因此一直沿用至今。
2.2、 细胞培养JEV灭活疫苗
随着细胞培养技术的发展, 疫苗生产进入了更加可控的阶段。考虑到鼠脑JEV灭活疫苗的安全性, 欧洲和日本开始使用细胞培养繁殖JEV。细胞培养JEV灭活疫苗与鼠脑JEV灭活疫苗在毒株、生产工艺和最终产品的配方等方面均存在明显差异。日本使用P1毒株生产Vero细胞源的JEV灭活疫苗。此外, IC51是一种Vero细胞源、氢氧化铝为佐剂的乙型脑炎SA14-14-2株灭活疫苗[5], 其是将SA14-14-2株在PDK细胞传代后又在Vero细胞上传代若干次, 使其E蛋白基因第138和176位发生突变, 最终得到IC51毒株[6]。IC51疫苗中不含任何明胶或防腐剂等稳定剂。自2009年以来, IC51已在包括美国、欧洲、加拿大、澳大利亚、瑞士和印度在内的许多国家获得了3个商业许可 (IXIARO、JESPECT和JEEV) 。
1968年, 中国开始生产原代地鼠肾细胞培养的JEV灭活疫苗 (将P3株接种原代地鼠肾细胞, 收获的病毒经甲醛灭活制成疫苗) 是1968～2000年间使用的主要JEV疫苗。该疫苗大大降低了过敏反应发生率, 免疫原性和安全性都明显提高。之后在此灭活疫苗的基础上增加了纯化工艺制备出的原代地鼠肾细胞纯化JEV疫苗, 取得了良好效果。1998年, 获批Vero细胞源的乙型脑炎P3株灭活疫苗是目前国内使用的主要灭活疫苗, 但逐渐被SA14-14-2株弱毒疫苗所取代。
2.3 、细胞培养JEV减毒活疫苗
1989年, Yu[7]获得了JEV SA14-14-2减毒株系, 并以此制备了地鼠肾细胞JEV减毒活疫苗, 在中国获得许可上市。该疫苗是将JEV SA14-14-2减毒株病毒接种于原代地鼠肾单层细胞, 经培育后收获病毒液, 加保护剂冻干制成。WHO疫苗安全顾问委员会对SA14-14-2疫苗的安全性进行评价, 认为其不良反应轻微, 无神经学不良反应。该疫苗对小白鼠、豚鼠和猪免疫1次后可产生较为理想的保护力或抗体反应, 保护效果好, 保护时间长。JEV SA14-14-2减毒活疫苗已加入国家计划免疫程序, 对全国儿童进行预防接种。目前SA14-14-2减毒活疫苗是JEV流行国家使用最广泛的疫苗, 已在尼泊尔、斯里兰卡、韩国、柬埔寨、老挝、缅甸、泰国和印度获得疫苗上市许可[8]。
2.4 、兽用JEV疫苗
目前, 国内兽用JEV疫苗有鼠脑灭活疫苗和地鼠肾细胞活疫苗两种。灭活疫苗采用猪JEV HW1株脑内接种小白鼠, 将收获感染的小白鼠脑组织制成悬液, 经甲醛溶液灭活后, 加油佐剂混合乳化制成。由于使用了鼠脑组织培养, 可导致神经系统不良反应, 因此市场上应用很少。活疫苗采用JEV SA-14-14-2株接种地鼠肾原代细胞培养, 收获病毒培养液, 加适宜保护剂, 经冷冻真空干燥制成。原代细胞源活疫苗的生产存在批次差异大, 成本高的缺点。
猪JEV灭活疫苗 (GD株) 是选用猪源GD株, Vero细胞为基质制备的灭活疫苗, 对猪安全, 可刺激小鼠机体产生良好的免疫应答, 对小鼠的保护率高, 目前该产品正在进行临床试验。猪JEV活疫苗 (传代细胞源, SA14-14-2株) 选择了一种对猪安全、适宜于乙脑SA14-14-2株增殖的Vero传代细胞系作为疫苗生产用细胞基质制备, 对猪安全有效。目前该产品已完成临床试验。
3、 JEV疫苗研发进展
3.1、 基因工程亚单位疫苗
JEV的结构蛋白为C蛋白、PrM蛋白及E蛋白。C蛋白是JEV的基础蛋白;M蛋白是病毒诱发保护性免疫的重要协同成分, 能诱生具有轻度中和作用的抗体;PrM蛋白是M蛋白的前体, 是未成熟病毒体的一部分, 其在病毒出芽过程中发挥重要作用。E蛋白作为JEV最主要结构蛋白, 是JEV的保护性抗原, 具有血凝活性, 并且能刺激机体产生中和抗体, 是体外中和作用的主要靶位点, 也是特异性抗体的作用位点[9]。因此, 利用JEV E、M蛋白研究安全、高效、廉价的新型疫苗防制JEV具有十分重要的意义。
Zhang等[10]采用果蝇表达系统成功表达了重组JEV E蛋白, 他们将编码JEV PrM、E蛋白的基因序列克隆到果蝇表达载体pAc5.1/v5-His中, 然后用该重组载体转染果蝇S2细胞系, 成功构建稳定表达重组JEV E蛋白的细胞系, 用该重组蛋白免疫小鼠能诱导小鼠产生特异性的中和抗体。Hua等[11]成功构建了稳定表达JEV病毒样颗粒的BJ-ML细胞系, 该细胞系能将JEV病毒样颗粒分泌到培养液上清中, 抗原表达量高达15～20 μg/mL, 用该抗原免疫小鼠后能产生高滴度的中和抗体, 攻毒后能产生100%的保护, 可作为一种安全有效的JEV亚单位疫苗候选物。
3.2、 病毒样颗粒疫苗
病毒样颗粒 (VLP) 是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒, 缺乏调节蛋白和感染性核酸, 无复制和感染能力, 保持了病毒抗原蛋白的天然构象, 因而具备激发宿主先天性和适应性免疫反应功能。VLP技术已广泛用于疫苗的研发与生产中。
张艳芳等[12]将JEV PrM、E及其信号肽基因片段克隆到穿梭载体AcBacmid中, 构建重组穿梭载体AcBac-prME。Lipofectine介导其转染Sf9细胞, 获得重组杆状病毒Ac-prME。该病毒在Sf9细胞中高效表达, 且形成了病毒样颗粒。该病毒样颗粒免疫可使小鼠获得有效抵抗JEV强毒株攻击的能力, 保护率高达100%, 从而为研制基于JEV样颗粒的亚单位疫苗奠定了基础。De Wispelaere等[13]将基因Ⅲ型JEV毒株PrM、E蛋白编码基因插入慢病毒TRIP载体, 构建JEV VLPs, 在小鼠和仔猪模型中能够高效诱导高滴度的抗JEV中和抗体, 诱导对JEV感染的保护性体液免疫应答, 此外, 还可诱导针对JEV基因Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型的中和抗体反应。Matsuda等[14]通过合成经过密码子优化的PrM、E基因成功研制出JEV-Nakayama毒株病毒样颗粒疫苗 (NVLP) 。用该病毒样颗粒感染家蚕Bm-N细胞后通过蛋白印迹和荧光检测法均可检测到重组JEV Nakayama-BmNPV (JEV-NNPV) 病毒的表达。将该重组体接种蝉蛹, 3 d后蝉蛹匀浆中的NVLP产量达到峰值, 每只蝉蛹大约能生产300～500 μg的E蛋白。此外, NVLP对鸡红细胞具有强烈的血细胞凝集 (HA) 活性。经NVLP免疫后产生的中和抗体能有效的中和JEV Nakayama株、Beijing-1株和MUAR株。因此, 该疫苗可用于控制亚洲国家JEV, 且具有成本低、免疫效果好的优点。目前, JEV基因Ⅰ型已经取代基因Ⅲ型成为优势基因型, Fan等[15]开发了一种可表达JEV基因Ⅰ型病毒样颗粒的系统, 能稳定表达并连续分泌基因Ⅰ型VLP, 形成均匀的空颗粒。对其免疫原性和保护力进行评价发现, 该病毒样颗粒与JEV基因Ⅰ型病毒有相似的抗原活性, 该病毒样颗粒能对JEV基因Ⅰ～Ⅲ型均有交叉保护作用。接种该病毒样颗粒后用JEV基因Ⅰ、Ⅲ型攻毒, 未出现发热和病毒血症现象, 并且在脑淋巴结和扁桃体中均未检测到病毒核酸, 表明该病毒样颗粒能有效防止猪群JEV基因Ⅰ、Ⅲ型病毒的感染。
3.3 、嵌合病毒减毒活疫苗
嵌合病毒可大幅度降低被替换结构基因的病毒毒性, 是JEV疫苗发展的一个新方向。研究表明, 黄热病毒减毒株YFV17D是一种安全有效的嵌合病毒载体, 单次免疫后即能产生高滴度的中和抗体[16]。Appaiahgari等[17]将JEV SA14-14-2株PrM和E蛋白替换黄热病毒17D株cDNA的对应位置, 保留黄热病毒17D株的C蛋白、非结构蛋白与病毒复制相关部分基因序列, 构建了黄热—乙脑嵌合病毒 (YF-JE) , 将其在Vero细胞上培养, 制备减毒活疫苗ChimeriVax TM-JE, 该疫苗对小鼠保护性好, 且无中枢毒性;对人有较高的免疫原性, 接种成人和儿童后均能诱导机体产生高滴度的中和抗体, 并且超过90%的成人在接种疫苗5年后血清中仍有保护性抗体, 超过80%的儿童在初次免疫2年后血清中仍有保护性抗体[18]。此外, 蚊子喂食含有高滴度的黄热—乙脑嵌合病毒的人工血液后, 并没有感染该病毒, 表明蚊子可能不会将病毒从一个接种疫苗的个体传播到另一个宿主[19]。猪接种该疫苗后也没有出现明显的病毒血症, 证明该疫苗在自然界中难以传播, 毒力不易返强[20]。目前该疫苗已在澳大利亚注册成功。
3.4 、多表位疫苗
多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型分子疫苗, 同时携带多个目标抗原相关及辅助性表位的疫苗, 能够被多种遗传背景的MHC分子识别、结合, 从而得到高效的递呈, 具有安全性好、保护力强和可有效调控应答类型等优点。将JEV蛋白上主要的细胞表位构建到原核表达载体中, 表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠, 能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应, 对致死量的JEV感染具有保护作用, 这为研究安全有效的JEV提供了新的思路和方法。钟登科等[21]以酵母菌表达的JEV E蛋白多表位肽构建了重组酵母菌株X33 (pPICZ-MP) , 并分泌表达多表位肽rMP;纯化后的rMP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应, 可保护小鼠免受致死量JEV的攻击。这些研究为流行性JEV多表位疫苗的研制提供了新思路。
3.5、 DNA疫苗
DNA疫苗是将含有编码目的抗原蛋白基因序列的质粒导入宿主细胞, 通过转录系统表达抗原蛋白, 诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答, 从而达到免疫目的的新型基因工程疫苗。由于DNA疫苗易生产、价格低、便于储存和运输等特性, 已成为国内外研究的热点。目前上市的兽用DNA疫苗主要有H5亚型禽流感DNA疫苗、马用西尼罗河热 (WNV) 疫苗和大西洋鲑鱼传染性造血组织坏死病毒 (IHNV) 疫苗[22]。Li等[23]将制备表达JEV E蛋白的DNA候选疫苗pCAG-JME免疫小鼠后, 能诱导小鼠产生高水平的中和抗体, 攻毒保护试验显示该疫苗对小鼠具有100%保护作用。虽然DNA疫苗在小鼠试验中效果较好, 但免疫大动物后免疫原性较差。为了克服这一缺点, 研究人员不断从基因优化、佐剂配方、疫苗接种方式等方面进行改进, 目前电穿孔 (EP) 传递方法通过瞬时电脉冲将高分子药物递送到细胞中, 用低剂量的DNA疫苗即可诱导强烈的免疫反应。EP作为一种有效传递方法, 可能在DNA疫苗接种方面具有广阔的应用前景[24]。Ketloy等[25]在猪体内试验2种乙脑DNA疫苗以评价其免疫原性 (2种疫苗质粒均包括JEV的前膜蛋白 (PrM) 的信号肽、前膜蛋白及外壳的编码区域, 仅载体质粒有所不同, 分别命名为PCJEME和PNJEME) , 结果发现, 二者免疫原性无显着差别。应用2种100～450 mg DNA疫苗 (相隔3周) 免疫猪1周后血凝抑制抗体达1∶40～1∶160, 并且能维持245 d以上, 说明这两种DNA疫苗在较长的一段时间内均能诱导病毒特异性记忆B细胞产生抗体。DNA疫苗能够诱导良好的体液免疫反应和较强的细胞免疫应答, 是未来疫苗重要技术发展方向之一。
4、 JEV疫苗研发展望
4.1、 生产工艺优化
4.1.1、 培养工艺的提升
目前, 国内商品化JEV疫苗均采用传统转瓶培养方式, 存在细胞易污染、劳动强度大等缺点。与转瓶培养工艺相比, 反应器悬浮培养获得的细胞密度、病毒效价、产品质量均明显提高, 生产能耗大幅降低。熊炜等[26]将JEV SA14-14-2株接种于BHK-21细胞悬浮液中培养, 将培养的JEV毒液依次进行冻融和离心, 收集JEV抗原, 制备猪JEV疫苗。刘钿莲等[27]将Vero种子细胞加入300 L生物反应器中, 与微载体一起进行灌流培养5～6 d后, 沉降微载体和细胞, 以维持液替换培养基, 接种JEV继续进行灌流培养, 收集病毒培养液, 过滤、灭活并纯化。此方法提高了细胞密度, 实现大规模、高密度培养, 消除了产品批次间差异和培养周期的不稳定性, 提高了产品质量。
4.1.2、 病毒抗原的纯化
目前, 国内商品化的猪JEV疫苗纯化相对落后, 疫苗大多直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产, 受培养基成分、细胞破碎产物和细胞代谢产物等影响, 动物免疫疫苗后易发生过敏、发热等不良反应, 故提高病毒抗原纯净性是提升疫苗质量的基本途径。高军等[28]将凝胶过滤层析所获得的病毒蛋白溶液进行阴离子交换层析, 使DNA牢固吸附在离子交换介质上而病毒蛋白穿透而过, 从而达到去除宿主DNA的目的, 提高疫苗产品质量。此外, 高军等[29]通过中空纤维膜对病毒收获液进行微滤处理, 有效去除残留的DNA, 从而使成品疫苗DNA残留量达到合格标准。丁旭娜等[30]采用了微滤澄清纯化法、超滤浓缩纯化法及重复洗滤法等一系列工艺, 最大限度地增大JEV的回收效率, 制备的猪JEV浓缩液成品疫苗具有纯净度高、安全性高及免疫效果好等优点。李旭等[31]应用CaptoCore700复合介质使JEV分子从凝胶表面流过, 宿主蛋白等小分子杂质被凝胶内正电荷基团吸附, 宿主蛋白去除率为64.48%～70.35%, 可将纯化灭活液的上样体积由15%柱体积提高至300%, 达到分离纯化效果。
4.1.3、 佐剂的应用
佐剂可以是分子、化合物或大分子聚合物, 能非特异性地调节或增强抗原自身的免疫原性, 引起强烈和持久的免疫反应的物质, 在疫苗研发中有着重要的作用。刘洪明[32]将603纳米、Gel01、ISA206、IMS1313佐剂和灭活的猪源基因Ⅰ型SCYA201201株细胞培养物混合制备成4种不同佐剂灭活疫苗, 在小鼠体内进行抗体消长规律、攻毒保护及免疫小鼠后的免疫应答试验, 结果显示, Gel01佐剂疫苗免疫小鼠后, 抗体水平最高, 对JEV保护率100%, 刺激小鼠体液免疫和细胞免疫应答效果最好。刘扶摇等[33]测定水性疫苗佐剂MontanideTM Gel01 ST (Gel01 ST) 稀释猪JEV活疫苗协同免疫小鼠后的攻毒保护情况, 结果显示, Gel01 ST佐剂稀释的活疫苗免疫小鼠后, 从第4天开始其血清抗体水平明显高于无佐剂组, 且从第7天开始可对小鼠提供100%的攻毒保护效力。Gel01 ST 佐剂能很好地诱发免疫小鼠的体液免疫应答, 增强猪JEV活疫苗的早期免疫保护。
4.1.4 耐热保护剂的应用
在疫苗运输过程中, 具有生物活性的制品在高温和长时间保存的情况下, 冻干物质可能产生物理和化学变化, 从而对活疫苗质量产生影响。耐热保护剂可确保病毒在2～8 ℃条件下保存24个月, 效价无明显下降, 即使在37 ℃也可保存10 d以上。其保护性能比传统保护剂更优良, 使活苗的储存、运输和使用更方便、经济。潘春刚等[34]研制了1种猪JEV活疫苗耐热冻干保护剂, 将其与猪JEV活疫苗病毒液混合, 冷冻干燥后即得冻干疫苗。耐热冻干保护剂配方简单, 制备便易, 适于大规模生产, 对疫苗具有良好的保护功效。巢伟等[35]研发了一种活疫苗的耐热冻干保护剂, 与常规的保护剂相比, 其更能有效地保护疫苗中病毒活力, 37 ℃耐热超过20 d, 2～8 ℃能保存2年以上, 降低了疫苗对温度保存条件的要求, 方便疫苗贮藏和冷链运输。
4.2、 新基因型疫苗研究的必要性
近年来, JEV流行区域的不断扩大及其流行优势基因型的改变给JEV防控带来了新挑战。JEV非疫区——西藏于2009年发现JEV感染[36]。1970年前, 中国流行的JEV主要为基因Ⅲ型, 1979年在云南发现JEV基因Ⅰ型的存在, 而后JEV基因Ⅰ型逐渐成为中国流行优势基因型[37,38,39]。目前, JEV活疫苗及灭活疫苗均属于JEV基因Ⅲ型疫苗。研究表明, JEV基因Ⅲ型疫苗可预防JEV基因Ⅰ～Ⅳ型感染。然而, 近期研究报道, JEV基因Ⅲ型疫苗对基因Ⅰ型病毒的保护效果可能存在差异, 使用JEV基因Ⅰ、Ⅲ型弱毒疫苗免疫猪2次发现, 不论是初次免疫还是2次免疫后, 免疫猪JEV基因Ⅰ型的中和抗体阳性率显着低于基因Ⅲ型[40,41]。需要认真评价JEV基因Ⅰ型疫苗研究的可行性和必要性。
1952年首次发现的JEV基因Ⅴ型毒株 (Muar株, 分离于马来西亚) 并未流行起来, 但其在2009年同时出现于东亚 (朝鲜) 和南亚 (西藏) , 为预防和控制JEV提出了新的挑战[42]。且JEV基因Ⅴ型和基因Ⅰ～Ⅳ型在分子生物学特性上有显着差异, 基因Ⅲ、Ⅴ型间的交叉免疫原性差。目前JEV疫苗对基因Ⅴ型感染的保护作用非常有限 (保护能力仅为50%) 。目前尚不知JEV基因Ⅴ型今后的流行趋势[43], 需要继续进行监测。
5、 小 结
乙型脑炎是一种由JEV引起的人畜共患病, 开发安全有效的JEV疫苗对人类和动物健康至关重要。JEV疫苗的开发始于20世纪40年代甲醛灭活小鼠脑源疫苗, 但这些疫苗存在一定副作用, 已于2011年5月停止使用。原代细胞源疫苗在预防猪乙型脑炎的早期发挥了重要的作用, 但其批次间质量差异大, 成本高, 逐渐被细胞源疫苗所代替。随着基因工程和蛋白质工程的发展, 以及对病毒分子结构和功能的深入研究, 一些新技术、新手段被应用到JEV疫苗研究中, 尽管科研人员在亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、嵌合病毒疫苗、多表位疫苗、DNA疫苗等方面做了很多基础试验研究, 但均处于实验室研究阶段, 应用到临床仍任重道远。研制猪JEV基因工程疫苗将成为预防猪乙型脑炎重要的发展方向。此外, 疫苗的品质提升离不开生产工艺技术的提升, 优化培养工艺、纯化病毒抗原、应用佐剂和耐热保护剂等策略为猪JEV疫苗品质提升提供了新的方向。相信随着研究的进一步深入, 将会研制出更安全、更有效的疫苗防控猪乙型脑炎。
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猪乙型脑炎病毒疫苗种类与研发情况 来源：网络整理
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